民党杀害，为除掉叛徒，减少对中央的危害，周恩来、陈赓等人设法暗杀白鑫。1929年11月11日晚11时，中央特别行动科的“红队”将白鑫击毙。1931年4月，原中共中央政治局候补委员、特科负责人兼三科科长顾顺章变节，供出了恽代英等中共高层领导人，中央机关受到了严重的破坏：“红队”暗杀了顾家九人。
1930年3月，离上海去莫斯科。7月，在联共第十六次代表大会上作报告。8月回上海。9月，和瞿秋白一起纠正李立三“左”倾冒险主义错误，主持召开中共六届三中全会。1931年1月中共六届四中全会上，王明把持中央，周恩来任政治局常委，中共中央军委书记。1931年12月，周恩来离开上海到中央革命根据地。先后任中央苏区中央局书记、中国工农红军总政治委员兼第一方面军总政治委员、中央革命军事委员会副主席。
1933年1月，中共临时中央由上海迁入苏区，同年秋，李德受共产国际派遣也从上海到达瑞金，任军事顾问。这时，正值国民党军队发动第五次“围剿”，中共中央总负责人博古（秦邦宪）遂完全依靠李德进行军事指挥，由于军事战略错误，第五次反“围剿”失败。中共中央与红军被迫实行战略转移。为统筹转移事宜，中央成立了三人团作为党和红军的最高领导机构。其中，博古负责政治，李德负责军事，周恩来负责监督军事计划的执行，史称“老三人团”。33年春，周恩来和朱德一起领导和指挥红军战胜了国民党军队对中央革命根据地的第四次“围剿”。
1935年1月中旬，中共中央在贵州遵义召开了政治局扩大会议。在遵义会议中，周恩来坚决支持支持毛泽东的正确主张，对实际确立以毛泽东为代表的新的中央的正确领导起了关键性的作用。遵义会议增选毛泽东为中央政治局常委，参加党和红军的决策；取消长征前组成的“三人团”，改为由朱德、毛泽东负责军事指挥，以周恩来为党内委托的在军事指挥上下最后决心的负责者。会后，中央政治局常委根据遵义会议决定进行分工，在毛泽东提议下，张闻天代替博古在党内负总责；毛泽东为周恩来军事指挥上的帮助者。随后在3月中旬，又成立了以周恩来为首，毛泽东和王稼祥为成员的三人军事指挥小组，亦称“新三人团”，全权指挥红军作战。不久周恩来罹患重病，毛泽东取代了周恩来军事指挥。1935年6月，红一、四方面军在四川懋功会师。为团结红四方面军，周恩来主动辞去红军总政委职务，由张国焘接任。9月，在南下与北上问题上红军正式分裂，中共中央突然率领红一方面军的三军团和军委直属队，脱离右路军中的四方面军部队，秘密连夜北上。10月19日，红一方面军到达陕西省吴起镇，与陕北红军会师。
1936年12月张学良和杨虎成发动武力拘禁蒋介石的“西安事变”后，周恩来以中共全权代表的身份，与秦邦宪、叶剑英等去西安同蒋介石谈判，和张、杨一起迫使蒋介石接受“停止内战、一致抗日”的主张，促成国共两党第二次合作，使团结抗日局面的形成，组成了抗日民族统一战线，国共合作共同抵抗日本侵略。
抗日战争时期，周恩来任国军政治部副主任兼第八路军驻渝办事处主任长期在武汉，重庆等地担当国共之间的党务交涉工作，同时主持了重庆《新华日报》的发行工作，宣传中共主张。代表中共长期在重庆及国民党控制的其他地区做统一战线工作，努力团结各方面主张抗日救国的力量，并先后领导中共中央长江局、南方局的工作。他坚持国共合作，积极团结民主党派、进步知识分子、爱国人士和国际友好人士，制止**逆流，克服对日投降的危险。
1938年，周恩来同王明在武汉主持中共长江局工作，坚持“一切经过统一战线”，后来在整风运动中被作为经验主义的代表遭到批判。
1939年7月，周恩来与**等人一起前往“华北联大”作题为《中国抗战形势》的报告，途中**所骑骡子在过小沟时惊吓了周恩来的坐骑，周摔下后正好撞在石岩上使右臂粉碎性骨折，事后蒋介石派自己的道格拉斯专机送周恩来赴苏联治疗（接到乌鲁木齐后由苏联方面接到莫斯科）。在苏联期间，周恩来除了向苏联与共产国际方面汇报工作外，也带回了共产国际对中共的一些资助。
1941年皖南事变发生后，周恩来为《新华日报》题诗：“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急！？”，对国民党军队的做法表示强烈抗议。同年，在中条山战役中国民党军队失败惨重，重庆《大公报》指责中共军队在山西招兵买马，游而不击，周恩来撰文谴责，后《大公报》将此文章一并发表。
1945年4月，中国共产党第七次代表大会召开，周恩来当选中央委员、中央政治局委员、中央书记处书记。1945年8月，成立以毛泽东为主席的中共中央革命军事委员会，周恩来任副主席。
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