1964年下半年，正在出访巴基斯坦的刘亚楼突然感到身体不适。回国后体检，医院认为他病情严重，怀疑肝癌。中央军委当即决定让刘亚楼停止工作住院治疗。但此时的刘亚楼哪里顾得了那么多，美国的无人侦察机不断入侵中国进行骚扰，几次出动飞机拦截，均未成功。10月15日，刘亚楼飞赴广东，与指挥员、飞行员及有关战勤人员分析无人驾驶侦察机的性能情况，给飞行员鼓劲。11月15日，美国无人驾驶侦察机在雷州半岛被击落。这时，他才遵照毛主席的叮嘱，接受治疗。11月16日，数十位国内一流专家组成医疗小组对刘亚楼的病情进行会诊，认为有可能是肝癌。医疗小组将刘亚楼的病情上报党中央和中央军委。毛泽东、周恩来等中央领导人都震惊了，毕竟刘亚楼还很年轻啊。他们当即指示：“赶快治，哪条件好到哪治！要全力以赴。”周恩来还特别指示：“暂不要将亚楼同志患肝癌之事向外透露，对家属尤其保密。”1964年11月26日，毛泽东在刘亚楼的信上批示：“亚楼同志，此件已阅，很好。闻你患病，十分挂念。一定要认真休养，听医生的话，不可疏忽。”1965年3月下旬，刘亚楼的病情开始恶化。此时，空政文工团的歌剧《江姐》和话剧《女飞行员》正在上海演出，他多次听取演出情况汇报，还找来编导和演员，研究观众的意见，修改剧本。1965年5月7日下午3时45分，这位年仅55岁的上将、空军司令员在上海病逝。刘亚楼逝世1小时后，他的夫人翟云英就收到了时任中共中央副主席、中央军委副主席、国防部部长林彪发来的唁电――林彪还亲自担任了刘亚楼治丧委员会的主任委员。